【PacBio】目標區域定序
設計目標區域引子對 (Specific Target Region Primers) 來進行目標區域基因放大與定序，進行大量樣品的目標區域研究。依照實驗設計不同，可使用三種不同的混樣策略：PacBio Barcoded Specific Primers、PacBio M13-tagged Barcoded Primers 或 PacBio Barcoded Adaptor 讓 Amplicon 連接上Barcodes，可支援 100 bp ~ 10 kb 的目標區域建庫與定序，形成高準確度的 HiFi reads 進行分析。可針對特定區域之 Structural variant detection、Minor variant detection、SNPs…等研究。
技術特點：
- PacBio HiFi reads 具有高準確度 (QV30) 且長片段的雙重優勢。
- 根據研究規模彈性選擇三種混樣策略
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| 實驗項目 | 總量 (μg) | 體積 (μl) | 建議濃度 (ng/ul) | OD260/280 | OD260/230 |
| Pacbio-barcoded Amplicon ★ | ≥ 3 | ≥20 | ≥ 50 | 1.8-2.0 | ≥ 2.0 |
★舉例說明：總量需求≥ 3 μg，樣品數30個，預計混樣成一個建庫，則每個Amplicon需求量為≥ 100 ng。
※< 1kb Amplicon因長度特殊性與系統本身限制，不保證於Sequel上機的數據輸出量。
| Experimental Goals | Coverage(fold,X) | 建庫規格 | |
| Full length consensus sequences | 30X Hifi coverage |
依照Amplicon Size進行不同規格建庫(100 bp-10 kb library) |
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| Minor variant detection | variants at 10% frequency | 600X Hifi coverage | |
| variants at 5% frequency | 1,200X Hifi coverage | ||
| variants at 1% frequency | 6,000X Hifi coverage | ||
| SNV Validation | 100X Hifi coverage per amplicon | ||